Protocolo

Para a realização desta prática foram necessários os seguintes materiais e reagentes:

• Tubo Falcon de 50 mL;
• Tubo Falcon de 13,5 mL;
• Pipetas Pasteur esterilizadas;
• Placa de Petri esterilizada com suporte para células animais;
• Centrífuga;
• Banho de aquecimento;
• Estufa de cultivo;
• Meio DMEM;
• Soro fetal bovino;
• Etanol 70%;
• Células congeladas em nitrogênio líquido.

O experimento foi iniciado com a preparação do meio de cultura celular, sendo adicionados 45 mL de meio DMEM e 5 mL de soro fetal bovino a um tubo Falcon de 50 mL. Deste tubo, uma alíquota de 5 mL foi transferida para um tubo Falcon de 13,5 mL. Na sequência, escolheu-se um pellet aleatório do reservatório refrigerado em nitrogênio líquido, o qual continha células B16-F10. O pellet foi submerso no banho de aquecimento e foi transferido para o tubo Falcon de 13,5 mL assim que começou o desgelo. O tubo foi homogeneizado e centrifugado a 1.000 G por 2 minutos, o sobrenadante foi descartado e foram adicionados 8 mL do meio do tubo Falcon de 50 mL. Com uma pipeta de Pasteur esterilizada, foi feita a homogeneização do meio e ele foi vertido em uma placa de Petri esterilizada com suporte para células animais. A placa foi identificada e levada à estufa de cultivo em temperatura de 37 °C.

Protocolo

Para a realização desta prática foram necessários os seguintes materiais e reagentes:

• Tubo Falcon de 13,5 mL;
• Eppendorfs de 2 mL;
• Micropipetas;
• Placa de Petri com cultivo celular com células B16-F10;
• Centrífuga;
• Estufa de cultivo;
• Meio DMEM;
• Soro fetal bovino;
• Etanol 70%.

A placa com células B16-F10 levada ao fluxo laminar para realizar a raspagem das células aderidas. Ela foi homogeneizada com álcool 70% e duas alíquotas de 10 µL foram adicionadas na câmara de Neubauer, sendo pipetada uma em cada lado da câmara. Em análise no microscópio, constatou-se uma concentração elevada de células no quadrante superior esquerdo, motivo pelo qual foi preparada outra placa, porém com uma diluição de 10 vezes. Foi realizada a diluição na proporção de 1:10, sendo pipetado 10 µL da solução de células com 90 µL do soro em um tubo eppendorf de 2 mL. O meio diluído foi então submetido contagem, que resultou em 30 células. Multiplicando pelo fator de diluição e pelo fator de 10^4 foi verificado que a concentração de células no meio preparado era de 3x10^6 cel/mL. O conteúdo da placa foi então transferido para um tubo Falcon de 13,5 mL e centrifugado por 5 minutos na velocidade 6. O sobrenadante foi descartado e no mesmo tubo foram adicionados 1,5 mL de meio DMEM e 1,2 mL de soro fetal bovino. Com a micropipeta, a solução foi homogeneizada e transferida para 3 eppendorfs de 2 mL, cada um recebendo 900 µL da solução e 100 µL do crioprotetor DMSO. Nestas condições, cada eppendorf ficou com um volume de 1 mL e uma concentração celular de 1x10^6 cel/mL, com 50% de meio, 40% de soro e 10% DMSO. Os três eppendorfs preparados foram imediatamente colocados sob refrigeração com nitrogênio líquido.

Protocolo

Utilizando uma pipeta Pasteur esterilizada foi realizada a remoção do meio DMEM da garrafa de cultivo que estava na estufa. Com outra pipeta esterilizada foram adicionados 3 mL do meio novo. Na sequência, a garrafa foi colocada na estufa novamente.
Foi realizado também o plaqueamento do cultivo de células preparado anteriormente, cuja concentração celular era de $71\times {10}^4$ cel/mL. Para chegar na quantidade de 5.000 células em cada poço, considerando 10 poços, calculou-se que seria necessária uma alíquota de 70 µL para serem obtidas 50.000 células. Cada poço tem capacidade para 100 µL, portanto em um tubo Falcon foram adicionados 930 µL de meio DMEM junto dos 70 µL do meio de cultivo. Com uma micropipeta foi realizada a homogeneização do meio e transferidos 100 µL para cada um dos 8 poços da placa de cultivo. Na sequência, a placa foi levada à estufa em 37 °C.