Proteínas
São muito complexas para serem sintetizadas quimicamente.
Formas de obtenção de proteínas:
- Purificação de fontes naturais: É possível quando a proteína é abundante na fonte.
- Recombinantes: Maioria.
Tecnologia do DNA recombinante
Uma série de técnicas que possibilitam a manipulação e combinação de sequências gênicas provenientes de diferentes organismos para as mais diversas finalidades. Abre portas para a expressão de proteínas em hospedeiros bacterianos, normalmente utilizando plasmídeos como vetores.
- Clonagem molecular de genes: isolamento de genes e construção de células/transgênicos.
- DNA recombinante: qualquer molécula de DNA composta por sequências derivadas de diferentes fontes.
- Vetores de expressão: Tem como função a obtenção de grandes quantidades de RNAs mensageiros estáveis que serão traduzidos produzindo grandes quantidades da proteína ou peptídeo de interesse. Devem possuir algumas estruturas essenciais.
Etapas:
- Isolar segmento de DNA/gene do restante do DNA;
- Realizar diversas cópias deste
- Análise posterior
Produção de proteínas recombinantes
- Facilidade de manuseio
- Rápido crescimento celular
- Fácil mudança de escala de produção
- Custo relativo baixo
- Produção eficiente de proteínas mais complexas
- Modificações pós-traducionais baseado em células de mamíferos
Para que a correta expressão possa ocorrer:
- O gene específico deve ser propagado;
- O gene deve ser transcrito corretamente;
- O RNA mensageiro correspondente deve ser traduzido em uma cadeia polipeptídica que possa ser convertida em uma proteína funcional.
Isso exige um conhecimento prévio sobre a estrutura e a organização do gene de interesse, vetor de expressão e escolha correta do hospedeiro.
Vetor de expressão
- Origem da replicação compatível com o organismo modelo;
- Uso de um marcador de seleção para selecionar células que contenham o plasmídeo que codifica a proteína de interesse, permite a diferenciação de células que possuem o DNA plasmidial das que não possuem;
- Clivagem do DNA plasmidial para inserção do gene de interesse através de sítios múltiplos de clonagem;
- Intensificar a amplificação e transcrição do gene através do estímulo das regiões promotoras.
Purificação de proteínas recombinantes
Há vetores de expressão que podem também promover a secreção da proteína da célula.
Para células que expressam a proteína em seu interior, é necessário, anteriormente à purificação, quebrar a membrana celular para liberar o conteúdo celular.
Sistemas de expressão
Há múltiplos Sistemas de expressão, baseados em diferentes hospedeiros:
- Sistemas bacterianos
- Sistemas com leveduras
- Sistemas com células de mamíferos
Para escolher um sistema de expressão, é necessário levar em conta fatores como
- tipo de proteína;
- seus requisitos de ativação e
- o rendimento desejado.
A expressão e produção de proteínas recombinantes funcionais é um processo desafiador, e busca-se novas ferramentas tanto que permitam a expressão funcional da proteína quanto o controle da transcrição e/ou tradução.